拜 qPCR 所赐我成功跻身实验室第一显眼包

　　压电陀螺淬灭校正真空电容器尊龙人生就是博i首选AG发财网凯尔系数做了一周的 qPCR，组会汇报秒变《现代艺术的鉴赏和理解》。导师发动实验室来评价我结果图。师兄找到了悬崖、师姐找到了瀑布……跟结果沾边的线条，我是一条也没有，成为实验室的最新笑柄，登上实验室第一显眼包的位置……赶着导师把我送到艺术学院之前，我必须拿下 qPCR，跑出梦中情图。

　　虽然引物和试剂都是大家验证过的，可偏偏会被我跑的奇奇怪怪，也无法找到问题所在。每次实验前都神神叨叨，结果却和别人判若两图，那么该如何才能拿到自己的梦中情图？

　　A1：扩增曲线存在问题时，首先应确认基线校正或 ROX 校正前的原始曲线，扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。使用嵌合荧光法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高，染料嵌入到初始模板 DNA 中发出荧光造成的。使用荧光探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。

　　A3：1.由于基线校正不恰当。确认设置的基线校正范围的参数，按仪器说明书要求重新设定再进行解析。

　　2. 使用的模板量过多，扩增曲线过早起峰，使基线校正不能正常进行。当扩增曲线 Cycles 以内起峰时，要将模板稀释 100～1,000 倍后使用。

　　Q4：如何选择制作标准曲线：为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品

　　。例如以基因组 DNA 为起始材料时就要选择基因组 DNA 作为标准品，进行 mRNA 表达解析时最好选择表达目的基因的 Total RNA（或以 Total RNA 为模板合成的 cDNA）作为标准品。即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导致 PCR 扩增效率不同（比如基因组 DNA 和质粒 DNA 等）。

　　A5：使用验证过的引物时，之前的融解曲线分析（Tm 值）可作为参考依据。如果 Tm 值与过去的验证结果相同，可以认为 qPCR 扩增产物与过去验证结果相同。

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　　结果显示，CN830 在延伸时间设置为 10 s 和 30 s 得到的 Ct 值高度相关，说明 CN830 使用快速反应程序能够获得良好的结果，反应速度方面优于其他公司产品。

　　使用 CN830 得到的扩增曲线和融解曲线，都显示出更高的荧光信号，扩增曲线线型更好，信噪比更高。

　　（纵坐标：室温放置 48 小时后的 Ct 值；横坐标：不进行室温放置的 Ct 值）

　　结果显示，即使将 Master Mix 放置 48 小时后再检测，得到的 Ct 值也没有变化。较长操作时间也可获得稳定结果。

　　*仅作为性能展示，请按照说明书标准操作进行实验：冰上配置反应液，尽快上机反应。

　　Takara Bio 中国有两家公司--宝生物工程（大连）有限公司和宝日医生物技术（北京）有限公司。宝生物工程（大连）有限公司是 Takara Bio Inc. 在中国的生产基地，宝日医生物技术（北京）有限公司负责 Takara Bio Inc. 旗下所有品牌在中国市场的宣传及销售。

　　宝日医生物技术（北京）有限公司成立于 2004 年 1 月，公司主要销售生物工程研究用试剂和仪器（包括 Takara、Clontech、Cellartis 品牌），产品主要包括 PCR/qPCR、基因克隆、基因功能研究、蛋白质功能研究、二代测序、干细胞研究等产品及服务，并可提供客户定制化服务。还开展以细胞治疗为中心的生物工程领域的技术开发与服务，销售细胞治疗和基因治疗相关产品。

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